微藻污水處理技術以藻細胞為主體代謝利用污水中的C、N、P等物質，該過程增殖的藻細胞既可用于生物質能源生產又可作為工業原料提取藻蛋白、微生物絮凝劑等，另外藻類光合作用過程對CO2的吸收也被認為是實現大氣碳固定的可行途徑。盡管微藻污水處理技術自提出已有50多年的歷史，但工藝和理論研究仍十分薄弱，諸如分離采收困難、細胞密度低等問題極大地限制了該技術的發展和應用。
微藻細胞較小、帶負電荷、密度接近于水等固有屬性的限制使得藻細胞在水中往往處于穩定的懸浮狀態，很難像活性污泥那樣通過重力沉淀實現分離。然而自然界中存在絮凝性藻類，1965年Golueke等發現池塘中的微藻在溫度較高且光線充足的時候能自然形成絮體。此后很多研究都證實了該現象的存在，目前基本認為微藻自絮凝是由兩種機制引發的：(1)高pH條件下鈣、鎂等離子形成帶正電的沉淀物，起到電性中和作用從而引發絮凝，(2)部分藻種在生理活動中產生具有絮凝作用的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)，EPS起到生物絮凝劑的作用從而引發絮凝。一些研究認為微藻絮體的形成過程也有絮凝性細菌的作用。微藻自絮凝能改善藻細胞沉降性、提高沉淀效率，然而自絮凝機理研究的相對缺乏極大限制了微藻污水處理技術的應用。因此研究微藻自絮凝特性及機理，對解決微藻污水處理技術應用中存在的藻細胞分離采收難題具有重要意義。
以往研究表明，小球藻表現出對各種污水環境良好的適應性、出色的污水處理效能和一定的油脂生產能力，但對小球藻自絮凝特性及機理研究相對不足，尤其對應用于污水處理的小球藻自絮凝特性缺乏了解。本文研究了污水處理小球藻自絮凝現象、絮體特性，初步探究了污水處理小球藻自絮凝機理，以期促進微藻污水處理技術的理論發展和實際應用。
一、材料與方法
1.1 藻種
從中國科學院淡水藻種庫購買藻種，主要研究能在污染水體中生存、分布廣泛、具有產油能力的Chlorellavulgaris(FACHB-8)作為研究藻種。用BG11(+N)培養基進行富集培養，以穩定期藻細胞作為接種藻種，接種到BG11(+N)、模擬生活污水中進行試驗研究。
1.2 模擬生活污水
2模擬生活污水以乙酸鈉(CODCr濃度為230~260mg/L)、NH4Cl(NH+4-N濃度為90~100mg/L)、KH2PO4(PO3-4-P濃度為7~9mg/L)分別作為有機碳源、氮源、磷源配制模擬生活污水，添加包含Mg、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、Co、Mo等微量元素的化學試劑，初始pH值控制在7.5~8.0。
1.3 光-SBR反應器及運行
采用兩個SBR反應器平行運行，分別命名為M1(BG11培養基，滅菌，透氣封口膜封閉)、M2(模擬生活污水，不滅菌，透氣封口膜封閉)。有效容積為500mL，置于磁力攪拌器上，攪拌速度為500r/min。將裝置整體置于光照培養箱中，培養條件：溫度為(25±1)℃，光照強度為2000lux，光暗時間比為13∶11。SBR運行周期為48h，沉淀時間為30min，排水比為60%。
1.4 微藻形態觀察
常規形態：采用生物顯微鏡(BX-51，Olympus，Japan)及數碼像機(SX600，Cannon，Japan)進行。
掃描電子顯微鏡觀察，從反應器中取出部分微藻，離心后去除上清液，加入2.5%戊二醛置于4℃冰箱中固定1.5h。用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10min，分別用體積濃度為50%、70%、80%和90%的乙醇進行脫水，每次10~15min，100%的乙醇脫水3次，每次10~15min。乙醇：乙酸異戊酯=1∶1、100%乙酸異戊酯各置換一次，每次15min，用臨界點干燥儀(HCP22，Hitachi，Japan)對樣品進行干燥，將樣品觀察面向上粘貼在掃描電鏡樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀(IB-5，Giko，Austria)在樣品表面鍍一層1500nm厚的金膜，將處理好的樣品用掃描電子顯微鏡(S-4300，Hitachi，Japan)進行拍照觀察。
1.5檢測方法
COD、NH+4-N、PO3-4-P、MLSS等指標采用國家規定的標準方法測定。沉淀效率計算如式(1)。
二、結果
2.1 微藻絮體形態變化
試驗過程中不同底物條件下微藻絮體形態變化如圖1所示，M1與M2接種藻種相同，均為BG11(+N)培養基富集后穩定期的小球藻。接種到BG11(+N)培養基-M1和模擬生活污水-M2中后，微藻聚集形態發生了明顯區別：M1中藻細胞密度增加、聚集形態仍為游離狀態為主，沒有發生藻細胞的聚集、粘附乃至絮凝，M2中運行到第20d就出現了類似活性污泥絮體的松散絮體結構，藻細胞粘附在絮體上，此后生物量進一步增加、絮體進一步增大，第60d時，M2中出現較為密實、尺寸較大的絮體。
2.2 沉淀效率變化
試驗過程M1和M2中微藻沉淀效率變化如圖2所示。0~10d，兩個反應器中微藻沉淀效率基本保持不變，該階段為微藻的適應期。15d后，M2中微藻沉淀效率明顯改善，從0~10d的平均33.83%提高到80.40%(55~60d)，M1中微藻沉淀效率也有所提高，但沉降性依然較差，從0~10d的平均31.74%提高到43.03%(55~60d)。上述結果表明，短沉淀時間能改善微藻沉降性、提高沉淀效率，并且對開放的微藻污水處理系統中微藻沉淀效率的提高作用更加明顯。
2.3 微藻顯微結構
如圖3所示，對M1、M2中的小球藻進行掃描電鏡觀察，以研究微藻絮體及內部顯微結構。從M1中小球藻細胞的掃描電子顯微鏡照片，可以看出，細胞表面較為光滑、沒有其他形態的藻類、細菌生長。M2中微藻絮體的掃描電子顯微鏡照片顯示，藻細胞表面較為粗糙，粘附一些絲狀、膠狀物質(胞外聚合物)，藻細胞黏附在絮體上，絮體內部充滿大大小小的孔隙。絮體內部除了球狀藻細胞外，沒有觀察到其他形態的藻細胞，但有大量的短桿菌、球菌。由于M1對基質進行滅菌處理、透氣封口膜封閉運行，因此保持了單一的微藻種群，M2中未對模擬生活污水進行滅菌處理，運行過程滋生了大量細菌，掃描電鏡照片表明這些細菌在藻細胞絮凝過程中具有重要作用。
2.4 絮體元素含量變化及成分分析
對M1、M2中小球藻進行掃描電鏡觀察的同時，利用能譜儀同步分析了主要元素的變化，結果如表1所示。由表1可知，基質條件的不同造成M1、M2中生物質元素含量具有明顯區別，M1中具有相對較高的Cl、K元素含量，而M2中具有相對較高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量。P、Fe、Mg、Ca元素是污水處理系統中形成無機物沉淀的主要元素，對微藻絮體的沉降性具有改善作用。
如圖4所示，微藻絮體XRD圖譜分析結果，與Jade6.0軟件中的標準文檔進行比較可知，衍射圖譜中大部分強峰與Ca4O(PO4)2一致。結合能譜分析結果，Ca、P元素在微藻自凝聚中具有重要作用。
三、討論
關于微藻自絮凝機理，目前比較公認的是兩種機制：(1)高pH條件下Ca、P等離子形成帶正電的沉淀物，形成電性中和作用從而引發絮凝，(2)部分藻種在生理活動中產生具有絮凝作用的EPS，EPS起到生物絮凝劑的作用從而引發絮凝。近年來，許多研究發現菌藻共生體系中微藻具有良好的絮凝性，逐漸發展出絮凝性細菌輔助微藻絮凝的理論。
3.1 高pH誘導絮凝
1984年，Sukenik等首次定量、系統性地研究了高pH下的微藻自絮凝現象，認為磷酸鈣是誘導自絮凝的關鍵沉淀物。Vandamme等在研究小球藻自絮凝時發現pH顯著影響絮凝效果。Sirin等在研究三角褐指藻的自絮凝時發現，pH值為10.5~11時生成的沉淀物主要為鎂沉淀物。上述研究將微藻自絮凝視為純粹的化學反應過程，忽略了微藻生理生化過程引起的絮體內部微環境pH改變以及細胞分泌物對藻細胞絮凝特性的影響。本研究中觀察到以模擬生活污水為底物的M2中具有相對較高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量，已有研究表明，P、Fe、Mg、Ca元素在活性污泥絮凝、好氧顆粒化中具有重要作用。基于該微藻自絮凝機理，P、Fe、Mg、Ca元素在微藻絮體的形成中具有重要作用，但作用機制可能不僅限于pH條件改變引起的化學沉淀。
3.2 EPS引發絮凝
EPS是微生物細胞外一層黏性基質，直接影響細胞表面特性，與廢水處理反應器中微生物聚集體的形態、結構、功能及生態均密切相關，在廢水生物處理中起重要作用。Zhang等研究表明，磷濃度能增加藻細胞生長和胞外有機物分泌。Boonchai等發現，饑餓處理后會引起微藻EPS產量的增加，氮饑餓條件下的微藻EPS具有相對較高的蛋白質含量。He等發現，Mg2+/Ca2+能改變微藻EPS中蛋白質的含量和類型，從而促進藻細胞在硅片表面的粘附。Salim等發現，EPS在E.texensis細胞的自凝聚中起主要作用，細胞表面粘附的主要物質為糖蛋白。Ge等發現，EPS中糖類/蛋白質比能更好地反映微藻沉降性能，而不是簡單的EPS總量。這些研究表明EPS對微藻細胞表面特性、絮凝性能的影響十分顯著。M2中微藻細胞表面的絲狀、膠狀物質就是胞外聚合物，因此，有必要從EPS的角度研究微藻自絮凝機理，探究EPS在微藻顆粒化過程中的作用機制。
上述兩種自絮凝機制能較好地解釋實驗室純培養條件下一些微藻的自絮凝現象，然而近年來在微藻污水處理系統的研究中，越來越多的證據表明細菌在微藻自絮凝過程中具有重要作用。
3.3 絮凝性細菌輔助絮凝
菌藻共生體系的絮凝現象很早就引起研究人員的注意。Lee等研究發現，Flavobacterium、Terrimonas、Sphingobacterium對Chlorellavulgaris培養物絮凝活性影響顯著。一些絲狀真菌也具有良好的與藻細胞結合的能力，例如Rhizopusoryzae、Penicilliumexpansum和Mucorcircinelloides等與微藻共培養，在實驗室優化條件下可形成較大的顆粒(直徑為2~5mm)。M2中掃描電鏡照片觀察到絮體內部具有大量的短桿菌、球菌，表明這些細菌在藻細胞絮凝過程中具有重要作用。
開放的污水處理系統中具有非常復雜的微生物群落結構，相應地構成復雜菌藻共生體系。微藻與細菌關系主要有兩類，互利共生-相互利用代謝產物、競爭抑制-對營養物質的相互競爭。如何利用菌藻之間的互利共生關系，較好地構建菌藻系統是將其應用于污水處理的前提之一。本研究中細菌的分子生物學鑒定、菌-藻關系以及菌藻共生體形成機理有待進一步研究。
本研究中微藻自絮凝的現象無法以上述任一單一機理進行解釋，尤其對開放的微藻污水處理系統，其作用過程包括藻-藻、菌-藻、菌-菌以及微藻、細菌與污水中物質的多重作用。另外微藻、細菌生理生化過程對微環境條件的改變也十分復雜，因此有必要對微藻絮凝特性、過程以及機理進行進一步深入研究，以便進一步明確微藻自絮凝機理，從而指導微藻污水處理技術的發展應用。
四、結論
(1)以短沉淀時間運行，環境選擇壓力下小球藻在模擬生活污水中會發生自絮凝，沉降性良好。
(2)污水處理小球藻藻細胞表面粗糙，粘附絲狀、膠狀物質，絮體中含有大量短桿菌、球菌。
(3)污水處理小球藻具有相對較高的Na、P、Fe、Mg、Ca元素含量，絮體無機物質中主要形態為Ca4O(PO4)2。
(4)污水處理小球藻自絮凝是在短沉淀構成的環境選擇壓力誘導下，綜合胞外聚合物誘導絮凝、無機元素沉淀促進絮凝以及絮凝性細菌輔助絮凝共同作用的結果。（ >
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